TNNT2 Cardiomiopatia Felina
Una Novedosa Variante Intrónioca Homocigótica en TNNT2 se Asocia con la Cardiomiopatía Felina
Resumen (Background)
Contexto: La cardiomiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad genética del corazón y la causa más común de muerte cardíaca súbita en jóvenes. La MCH se considera una enfermedad del sarcómero debido al gran número de mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas. El enigma radica en descubrir cómo estas mutaciones conducen a la enfermedad, limitando los tratamientos a procedimientos invasivos.
La variante A31P de la proteína C de unión a miosina cardíaca, codificada por MYBPC3, se encontró más prevalente en gatos Maine Coon con MCH. Sin embargo, otras mutaciones en MYBPC3 y MYH7 también se han asociado con MCH en otras razas de gatos. En este estudio, ampliamos el espectro de genes asociados con la MCH en felinos.
Resultados: Se realizó la secuenciación de genoma completo de próxima generación (WGS) utilizando ADN aislado de sangre periférica de un Maine Coon con cardiomiopatía que resultó negativo para la variante A31P de MYBPC3. A través de la estratificación de riesgo de variantes, identificamos una novedosa variante intrónica homocigótica en la troponina T cardíaca (TNNT2). El análisis in silico sugirió que podría afectar el empalme normal del exón 3 de TNNT2.
Ambos padres dieron positivo como heterocigotos para la mutación, pero no estaban afectados por la enfermedad. Los análisis de ecocardiografía revelaron que el probando había mostrado insuficiencia cardíaca congestiva de inicio temprano, que se manejó con un régimen de tratamiento que incluía inhibidores de la ECA y de la aldosterona.
Conclusión: En resumen, somos los primeros en demostrar la asociación entre mutaciones en TNNT2 y la MCH en felinos, lo que sugiere que este gen debe incluirse en el panel de pruebas genéticas al realizar pruebas de MCH en gatos.
Introducción
La MCH es la forma más común de enfermedad cardíaca genética, afectando al menos a 1 de cada 500 humanos (Ho, 2011). Definida por un engrosamiento anormal inexplicado de las paredes ventriculares y posible obstrucción del tracto de salida, actualmente no existe cura.
La MCH es causada principalmente por mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas. En particular, las mutaciones en MYH7 y MYBPC3 son las más comunes (Viswanathan et al., 2017), aunque otros genes sarcoméricos, incluidos TNNI3, TNNT2 y MYL2, también han sido implicados en humanos (Brouwer et al., 2011).
MCH en Gatos: Un Modelo Crucial
En los gatos, la cardiomiopatía es la principal causa de enfermedad cardiovascular, siendo la MCH la forma más común, lo que sugiere que los gatos son un excelente modelo animal no roedor (Ferasin et al., 2003).
MYBPC3 (A31P): Previamente vinculado a MCH en gatos Maine Coon (Meurs et al., 2005). Se espera que cause la enfermedad a través de defectos estructurales en el dominio C0.
MYBPC3 (A74T): Descrito en múltiples razas, pero estudios posteriores demostraron que no está relacionado con la cardiomiopatía (Wess et al., 2010; Longeri et al., 2013).
MYBPC3 (R820W): Asociado con MCH, específicamente en la raza Ragdoll (Meurs et al., 2007).
MYH7 (E1883K): El primer variante en MYH7 asociado con MCH en un gato Doméstico de Pelo Corto (Schipper et al., 2019).
En el presente estudio, se investigó a un gato Maine Coon macho con cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca congestiva temprana. Tras dar negativo para la mutación A31P, realizamos WGS para identificar mutaciones y la causa genética de la cardiomiopatía. Hemos identificado una novedosa mutación autosómica recesiva en el gen de la troponina T cardíaca (TNNT2). Este es el primer registro conocido de dicha mutación en felinos.
Materiales y Métodos
Fenotipado, Recolección de Sangre y Extracción de ADN
Todos los procedimientos siguieron el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cincinnati. El diagnóstico, tratamiento y ecocardiografía fueron realizados por un cardiólogo veterinario certificado utilizando técnicas estándar y referencias de Maine Coon sanos (Thomas et al., 1993; Drourr et al., 2005).
El ADN se extrajo de una alícuota de 200
Secuenciación y Análisis de Genoma Completo (WGS)
El ADN del probando fue enviado a Novogene Co., Ltd., para WGS. El ADN fue fragmentado en fragmentos de
Análisis Bioinformático
Los datos de secuenciación (archivos FASTQ) fueron filtrados. Cada lectura limpia se mapeó al genoma de referencia (Felis_Catus_9.0, Ensembl release 93) utilizando el software BWA (Li and Durbin, 2009). Los duplicados se eliminaron con SAMTOOLS (Li et al., 2009). Se detectaron variantes de polimorfismo de nucleótido único (SNP) y InDel utilizando el software GATK (Depristo et al., 2011) y se anotaron con ANNOVAR (Wang et al., 2010).
Secuenciación Sanger
Para confirmar la variante en el probando y sus padres, se realizó PCR utilizando una polimerasa Taq de alta fidelidad. El producto de PCR se purificó y se envió para secuenciación Sanger.
Resultados
El probando era un Maine Coon macho de pura raza. A los 8 meses, presentó dilatación del ventrículo izquierdo, la aurícula derecha y de la aurícula izquierda limítrofe, e hipertrofia septal limítrofe, con función sistólica conservada-elevada. A los 14 meses, se notó un agrandamiento progresivo de las cuatro cámaras. Esto se diagnosticó como una cardiomiopatía primaria no clasificada con posible insuficiencia cardíaca congestiva temprana.
Figura 1. Cardiomiopatía en ausencia de la variante MYBPC3 A31P. (A,B), Ecocardiografía representativa y esquema de estratificación del riesgo de enfermedad cardiovascular de las variantes genéticas. Imágenes representativas en modo B (A) y modo M (B) de eje largo paraesternal del sujeto de prueba, con el ventrículo izquierdo (LV), la aurícula izquierda (LA) y el ventrículo derecho (RV) marcados. (C), El cromatograma de MYBPC3 A31P demostró que el sujeto de prueba era negativo para esta variante
Se inició un tratamiento con Furosemida, Benazepril, Espironolactona y Clopidogrel, que pareció estabilizar la progresión a los 18 meses. (Nota: El artículo original hace referencia a la Tabla 2, que detalla los parámetros ecocardiográficos de las mediciones seriales).
Figura 1. Cardiomiopatía en ausencia de la variante MYBPC3 A31P. (A,B), Ecocardiografía representativa y esquema de estratificación del riesgo de enfermedad cardiovascular de las variantes genéticas. Imágenes representativas en modo B (A) y modo M (B) de eje largo paraesternal del sujeto de prueba, con el ventrículo izquierdo (LV), la aurícula izquierda (LA) y el ventrículo derecho (RV) marcados. (C), El cromatograma de MYBPC3 A31P demostró que el sujeto de prueba era negativo para esta variante
Detección de la Variante TNNT2
MYBPC3 Negativo: La secuenciación Sanger confirmó que el probando era negativo para la variante A31P en MYBPC3 (Figura 1C).
WGS y Control de Calidad: Se enviaron 1.5
g de ADN para WGS. La secuenciación resultó en 177,419,470 lecturas crudas, con una profundidad promedio de 17.59 lecturas por base y una tasa de error del 0.03% (Figuras 2A-C). Estratificación de Riesgo: El análisis inicial reportó más de 20,000 variantes. Se aplicó una estratificación utilizando 174 genes del panel Illumina TruSight Cardio (Pua et al., 2016), reduciendo el número a 305.
Identificación de TNNT2: De las 305 variantes, solo una fue anotada con un impacto de "alto riesgo": una sustitución de un solo par de bases (G a A) dentro del intrón 3, correspondiente a c.95-108G > A de ENSFCAG00000004613 (Figura 3A).
Consecuencias Predichas y Validación
El análisis in silico de la variante sugirió que crea un sitio aceptor de empalme de novo. La consecuencia proteica revelada fue la posible pérdida de 223 aminoácidos carboxilo terminales y la incorporación de solo cinco aminoácidos nuevos, lo que dejaría a la proteína no funcional (Figura 3B).
Validación por Sanger: La secuenciación Sanger confirmó la homocigosidad de la variante c.95-108G > A en el probando (Figura 3C).
Análisis de Padres y Pedigrí: Se obtuvieron muestras de ambos padres, los cuales no mostraron patología cardíaca (datos no mostrados). Ambos padres resultaron ser heterocigotos para la variante (Figura 3C).
Consanguinidad: El pedigrí del probando reveló que fue producto de una cría consanguínea (Figura 4).
Estos resultados implican una novedosa mutación intrónica que conduce a la truncación de la troponina T cardíaca sarcomérica como la causa de la cardiomiopatía en este Maine Coon.
Tabla 3. Lista de secuencias de cebadores utilizadas en este estudio para comprobar la presencia de variantes en los genes MYBPC3 y TNNT2.
Dado que el sujeto era negativo para la mutación A31P en MYBPC3, nos preguntamos si había alguna otra variante que pudiera ser relacionada con la cardiomiopatía del gato. En consecuencia, se aisló el ADN en fresco para la WGS con el fin de identificar posibles variantes presentes en el sujeto. Se envió ADN de alta calidad con un tamaño aproximado de 22944 pb para la preparación de la biblioteca y la secuenciación por Novogene. Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia de Felis Catus (Ensemble release 93). La secuenciación dio como resultado 177419470 lecturas en bruto, con una profundidad media de 17,59 lecturas por base, una tasa de error de 0,03 y un 94,19% de lecturas de base con una puntuación Phred superior a 30 (Figuras 2A-C). El contenido de GC detectado fue del 43,06% en comparación con el genoma de referencia, que fue del 41,73%. En conjunto, estos datos demostraron una calidad suficientemente alta de los datos de secuenciación.
Figura 2. Control de calidad de los resultados de la secuenciación de próxima generación. (A) De 177.419.470 lecturas de secuenciación, el 99,95% eran lecturas limpias, mientras que sólo el 0,05% contenía contaminaciones relacionadas con adaptadores. (B) La cuantificación de la distribución de la calidad de la secuenciación a lo largo de las lecturas demostró la existencia de puntuaciones de alta calidad a lo largo de la totalidad de las lecturas, con un 94,19% de lecturas de base con una puntuación Phred superior a 30. (C) La distribución de la tasa de error a lo largo de las lecturas demostró una alta fidelidad de las lecturas con una tasa de error global del 0,03%. (D) Estrategia de estratificación de genes de miocardio utilizando 174 genes de la lista de genes del panel de cardio.
El análisis inicial informó de más de 20.000 variantes genéticas identificadas en el sujeto, en comparación con el genoma de referencia. Empleamos un paso de estratificación del riesgo de enfermedad cardiovascular para enriquecer las variantes asociadas a la enfermedad cardiovascular. Esta estratificación se realizó con 174 genes cubiertos por el panel Illumina TruSight Cardio (Pua et al., 2016). Este enfoque redujo el número de variantes a 305 (Figura 2D). De estas 305 variantes potenciales, solo una había sido anotada como de «alto riesgo». Esta variante en particular era una sustitución de un solo par de bases (G a A) dentro del intrón 3, correspondiente a c.95-108G > A de ENSFCAG00000004613. Esta variante dio lugar a la posible inclusión de un sitio aceptor de empalme de novo (Figura 3A). A continuación, utilizamos un análisis in silico para determinar la probabilidad de que esta variante intrónica actúe efectivamente como un nuevo sitio aceptor de empalme (Wang y Marín, 2006). Este método in silico identificó correctamente más del 96% de los donantes y aceptores de empalme canónicos dentro de TNNT2 (Tabla 4). Cabe destacar que el análisis in silico de la variante c.95-108G > A en el sujeto apoyó la hipótesis de que esta variante altera el empalme de TNNT2. La consecuencia de este empalme aberrante se investigó a nivel de la proteína, lo que reveló que la variante podía causar la pérdida de 223 aminoácidos terminales del carboxilo y la incorporación de sólo cinco aminoácidos nuevos, haciendo que la proteína no fuera funcional (Figura 3B).
Figura 3. Análisis de la variante TNNT2 c.95-108G > A. (A) Alineación de la secuencia genética de la TNNT2 de tipo salvaje y mutante. La variante está resaltada en gris, y el exón descendente está resaltado en rojo. (B) Alineación de la secuencia proteica de la proteína TNNT2 de tipo salvaje y la proteína predicha resultante de la variante TNNT2 c.95-108G > A. (C) Cromatogramas de secuenciación Sanger que demuestran la homocigosidad para la variante TNNT2 c.95-108G > A en el sujeto y la heterocigosidad en ambos padres.
Tabla 4. Predicción in silico de los sitios de empalme de los exones del gen TNNT2 (ENSFCAG00000004613) del gato.
Se realizó la secuenciación Sanger para validar la anotación WGS de la variante c.95-108G > A en el sujeto (secuencia del cebador en la Tabla 3). Llamativamente, esta secuenciación reveló homocigosidad de la variante c.95-108G > A en el sujeto, lo que sugiere aún más su asociación con la enfermedad (Figura 3C). Tras este hallazgo, se obtuvieron muestras de sangre de ambos padres del sujeto. La ecocardiografía no sugirió ninguna patología cardíaca en ninguno de estos padres (datos no mostrados). Se extrajo el ADN y se realizó una PCR para la secuenciación Sanger de la variante TNNT2. Llamativamente, ambos padres albergaban una única copia de la variante c.95-108G > A (Figura 3C). Este hallazgo llevó a investigar el pedigrí del sujeto. Se descubrió que el sujeto había nacido de un matrimonio consanguíneo (Figura 4). En conjunto, estos resultados implican una nueva mutación intrónica que provoca el truncamiento de la proteína sarcomérica, la troponina T cardíaca, como causa de la cardiomiopatía en este gato Maine Coon.
Figura 4. Pedigrí familiar del sujeto afectado. Los círculos y los cuadrados representan a los machos y las hembras, respectivamente, mientras que el azul y el rojo representan a los individuos no afectados y afectados, respectivamente. Un Maine Coon macho, heterocigoto para la variante TNNT2 c.95-108G > A, fue apareado con una Maine Coon hembra, lo que dio lugar a una cría hembra. Esta cría hembra, también heterocigótica, se cruzó con el macho original, produciendo dos crías. La cría macho fue el sujeto cardio miopático en este estudio y era homocigoto para la variante TNNT2 c.95-108G > A. El símbolo * indica que las muestras de estos gatos no estaban disponibles en el momento del estudio.
Discusión
Identificamos una novedosa variante intrónica homocigótica en TNNT2 asociada con un caso de cardiomiopatía felina e insuficiencia cardíaca temprana. Este es el primer informe de una mutación de filamento delgado asociada con cardiomiopatía felina.
Las mutaciones en TNNT2 se han implicado fuertemente en MCH y Cardiomiopatía Dilatada (MCD) en humanos (Watkins et al., 1995; Pasquale et al., 2012). En humanos, estas mutaciones en TNNT2 son fenotípicamente leves, pero con una mayor incidencia de muerte súbita.
El Rol de cTnT y Haploinsuficiencia
El gen TNNT2 codifica la proteína específica cardíaca troponina-T (cTnT). cTnT juega un papel central en la regulación de la contracción y relajación del corazón, anclando el complejo de troponina a la actina y la tropomiosina.
La truncación significativa de cTnT causada por la mutación probablemente previene la incorporación de la proteína truncada en el sarcómero. La reducción resultante en los niveles de cTnT daría lugar a una estequiometría anormal de las proteínas del filamento delgado, suficiente para causar cardiomiopatía.
Mecanismo Postulado: Es más probable que el empalme aberrante de TNNT2 sea un evento limitado, resultando en haploinsuficiencia de la proteína cTnT (Bollen et al., 2017). Se sabe que incluso menos del 5% de cTnT C-terminalmente truncada es suficiente para causar cardiomiopatía en ratones (Tardiff et al., 1998).
Descarte de Otras Variantes
Se identificaron dos variantes de nucleótido único en MYBPC3 con riesgo moderado (P922L y A1037T). Sin embargo, una investigación adicional reveló que estos aminoácidos no están conservados evolutivamente y coincidían con los de humanos o ratones, descartándolos como causantes de enfermedad.
Conclusión
Hemos identificado una novedosa mutación homocigótica en el gen sarcomérico TNNT2, que está asociada con cardiomiopatía en un gato Maine Coon. La homocigosidad de esta mutación resultó de la endogamia (inbreeding).
Este estudio es el primero en describir una mutación en TNNT2 asociada con cardiomiopatía felina, lo que sugiere que este gen debe incluirse en las pruebas genéticas de rutina en felinos. Además, los criadores deben ser conscientes de los peligros asociados con la cría consanguínea cercana entre generaciones.
Secciones de Referencia (Integración Completa)
Data Availability Statement
Los datos de secuenciación han sido depositados en la base de datos BioProject (número de acceso: PRJNA671288).
Ética
El estudio animal fue revisado y aprobado por Ref: AM07-19-10-03-01 del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito del propietario para la participación de sus animales en este estudio.
Contribuciones del Autor
JM y SS diseñaron la investigación y escribieron el manuscrito. JM y MS realizaron la investigación. JM, MS y SS analizaron los datos. MS y RB editaron el manuscrito. RB proporcionó supervisión del proyecto para datos clínicos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Financiamiento
La secuenciación de genoma completo del probando fue financiada por una donación de Kathleen y Michael Janson, propietarios del probando. JM fue apoyado por una beca postdoctoral de la American Heart Association (17POST33630095). SS recibió financiación de las subvenciones del National Institutes of Health (NIH) (R01 AR078001, R01 HL130356, R56 HL139680, R01 AR067279, R01 HL105826 y R01 HL143490), premios de transformación (19TPA34830084), y MyoKardia, AstraZeneca, Merck y Amgen.
Conflicto de Intereses
SS proporcionó consultoría y estudios de investigación colaborativos a la Fundación Leducq, Red Saree Inc., Greater Cincinnati Tamil Sangam, MyoKardia, Merck y Amgen, pero dicho trabajo no está relacionado con el contenido de este manuscrito. No se informan otras divulgaciones. RB forma parte de las juntas asesoras científicas de Janssen y Basking Biosciences y de los Comités DSMB para Ionis Pharmaceuticals, Akcea Therapeutics y Novartis. Los demás autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al personal de los hospitales veterinarios Warm Animal (Cincinnati), Big Creek (Cleveland) y Friendship (Washington DC) por realizar las extracciones de sangre. También agradecemos a Linda Komar y Joseph Keyerleber por organizar los envíos de sangre de los padres del probando. La secuenciación Sanger fue realizada por el DNA Sequencing and Genotyping Core del Hospital Infantil de Cincinnati. Este manuscrito ha sido publicado como pre-impresión en Research Square (McNamara et al., 2020).
Citas y Palabras Clave
Palabras Clave: Cardiomiopatía Hipertrófica, Maine Coon, MYBPC3, TNNT2, sarcómero
Cita: McNamara JW, Schuckman M, Becker RC and Sadayappan S (2020) A Novel Homozygous Intronic Variant in TNNT2 Associates With Feline Cardiomyopathy. Front. Physiol. 11:608473. doi: 10.3389/fphys.2020.608473
Recibido: 20 de septiembre de 2020; Aceptado: 26 de octubre de 2020; Publicado: 16 de noviembre de 2020.
Correspondencia: Sakthivel Sadayappan, sadayasl@ucmail.uc.edu †Dirección actual: James W. McNamara, Murdoch Children’s Research Institute, The Royal Children’s Hospital, Parkville, VIC, Australia
